خواص ضد میکروبی گرده جمع‌آوری‌شده توسط زنبور و نان زنبور: کاربردهای کنونی و پتانسیل آینده

خواص ضد میکروبی گرده جمع‌آوری‌شده توسط زنبور و نان زنبور: کاربردهای کنونی و پتانسیل آینده

چکیده

گرده جمع‌آوری‌شده توسط زنبور (BCP) یک غذای کاربردی شناخته شده است. زنبورهای عسل گرده های جمع آوری شده را پردازش کرده و در داخل کندو و سلول های شانه ذخیره می کنند. گرده فرآوری شده، نان زنبور یا آمبروسیا نامیده می شود و منبع اصلی پروتئین ها، لیپیدها، ویتامین ها، عناصر ماکرو و میکرو برای تغذیه زنبورهای عسل است. در طول نگهداری، نان زنبور تحت تخمیر حالت جامد قرار می گیرد که آن را حفظ کرده و زیست فراهمی مواد مغذی آن را افزایش می دهد. تحقیقات بر روی نان زنبور تاکنون نسبتا محدود بوده است. در سال‌های اخیر، به دلیل مقاومت ضد میکروبی در حال ظهور توسط پاتوژن‌ها، علاقه فزاینده‌ای نسبت به خواص ضدمیکروبی BCP و نان زنبور وجود دارد. هم BCP و هم نان زنبور خواص ضد میکروبی را در برابر پاتوژن های مختلف مانند باکتری ها و قارچ ها از خود نشان می دهند. همانطور که در مورد سایر محصولات زنبور عسل وجود دارد، فقدان مقاومت ضدمیکروبی ممکن است به هم افزایی بیش از یک ترکیب ضد میکروبی درون BCP و نان زنبور نسبت داده شود. علاوه بر این، BCP و نان زنبور به روشی هدفمند علیه عوامل بیماری زا فعالیت می کنند و بر میکروبیوم میزبان به روشی پری بیوتیک اثر می گذارند. این بررسی با هدف ارائه یافته‌های پژوهشی به‌روز در مورد این جنبه‌ها و همچنین بحث در مورد چالش‌های کنونی و چشم‌اندازهای آتی در این زمینه می‌باشد.

کلمات کلیدی: محصولات زنبور عسل؛ گرده جمع آوری شده توسط زنبور؛ نان زنبور؛ فعالیت ضد میکروبی؛ میکروبیوم؛ غذای کاربردی؛ مقاومت آنتی بیوتیکی

مقدمه

محصولات زنبور عسل (عسل، گرده جمع آوری شده توسط زنبور، نان زنبور، ژل رویال، بره موم، زهر زنبور، موم) از زمان های قدیم به عنوان درمان های سنتی به طور گسترده مورد استفاده قرار گرفته اند. امروزه علاقه فزاینده ای به محصولات زنبور عسل، زیست فعالی آنها و کاربرد آنها در طب جایگزین و درمان با محصولات زنبور عسل وجود دارد.

عسل تنها غذای شیرین و پرانرژی موجود برای انسان های اولیه بود. بنابراین، برخی از انسان شناسان بر این باورند که عسل یکی از عوامل اصلی محیطی بود که به تکامل سریع مغز انسان کمک کرد [1]. عسل فعالیت ضد باکتریایی [2، 3، 4] و ضد قارچی [5] را به صورت آزمایشگاهی از خود نشان می دهد، اما این ویژگی ها در بین انواع مختلف عسل بسیار متفاوت است [6]. این خواص بیولوژیکی به عوامل فیزیکی و شیمیایی مانند pH پایین، محتوای قند بالا (اسمولالیته بالا)، تولید پراکسید هیدروژن از فعال شدن گلوکز اکسیداز و علاوه بر آن به سایر ترکیبات شیمیایی مانند متیل گلیوکسال، 3-فنیل لاکتیک اسید (PLA)، دیفنسین-1 زنبور عسل، پروتئین‌های اصلی ژل رویال (MRJPs) و باکتریوسین‌ها [7] نسبت داده می‌شود. عوامل بیولوژیکی مانند میکروبیوم عسل ممکن است به این خواص کمک کنند، اگرچه نقش آن به طور کامل مشخص نشده است. عسل یک اثر ضد التهابی اعمال می کند که می تواند به سرعت درد و التهاب را کاهش دهد و در نتیجه به بهبود زخم کمک کند [6]. همچنین بسته به منشأ گیاهی خود، خواص آنتی اکسیدانی متفاوتی از خود نشان می دهد. انواع مختلف عسل دارای خواص ضد سرطانی گزارش شده است [8، 9، 10، 11، 12]. علاوه بر این، عسل به عنوان یک غذای پری بیوتیک در نظر گرفته می شود که به طور مثبت بر میکروبیوم و سلامت انسان تأثیر می گذارد [13، 14، 15].

بره موم عمدتاً از رزین هایی تشکیل شده است که زنبورهای عسل از ترشحات موجود در جوانه های درخت، جریان شیره یا سایر منابع گیاهی جمع آوری می کنند و سپس در داخل کندو با بزاق زنبور و موم مخلوط می شوند. از آن برای آب‌بندی ترک‌ها و فضاهای کوچک استفاده می‌شود تا از کندو در برابر مهاجمان یا شرایط آب و هوایی سرد محافظت کند. با این حال، مهم‌ترین کاربرد آن در ضدعفونی است، زیرا زنبورهای عسل قبل از استفاده، دیواره‌های کندو و سلول‌های شانه‌ای که برای پرورش نوزادان یا ذخیره مواد غذایی استفاده می‌شوند، را با بره موم می‌پوشانند. استفاده از بره موم توسط کلنی زنبورعسل را می توان به عنوان عاملی برای مصونیت اجتماعی در نظر گرفت [16]. بره موم دارای خواص بیولوژیکی متنوعی از جمله خواص ضد باکتریایی، ضد قارچی، ضد ویروسی و همچنین خواص آنتی اکسیدانی، ضد التهابی و ضد سرطانی است [17، 18].

ژل رویال (RJ) توسط غدد هیپوفارنکس زنبورهای بسیار جوان به نام زنبورهای پرستار تولید می شود. این تنها غذای ملکه زنبور عسل است. زنبورهای پرستار، لاروهای جوان، زنبورهای نر جوان، و زنبورهای کارگر کلنی را با ژل رویال تغذیه می کنند [19]. ژل رویال به دلیل فعالیت ضد التهابی و تنظیم کننده سیستم ایمنی شناخته شده است [20]. علاوه بر این، اجزای ژل رویال مانند ترانس-10-هیدروکسی-2-دکنوئیک اسید، رویالیسین، پروتئین‌های اصلی ژل رویال (MRJPs) و محصولات حاصل از تجزیه آن‌ها ژلین‌ها [21، 22]، و همچنین گلوکز اکسیداز در فعالیت ضد میکروبی علیه باکتری‌ها، قارچ‌ها و ویروس‌ها نقش دارند [23، 24].

زهر زنبور عسل (BV) به دلیل اثرات ضد میکروبی، ضد التهابی [25، 26]، محافظت کننده عصبی [27] و ضد سرطانی [28] شناخته شده است. خواص ضد میکروبی BV به صورت آزمایشگاهی و درون‌تنی علیه باکتری‌ها، ویروس‌ها و قارچ‌ها نشان داده شده است [29]. برهم‌کنش‌های درمانی هم‌افزایی زهر زنبور عسل با آنتی‌بیوتیک‌ها نیز گزارش شده است [30]. علاوه بر این، BV فعالیت کشندگی انگل تریپانوزوما را نشان داده است [31] و به نظر می رسد از مرگ سلول های عصبی ناشی از پپتیدهای پریون جلوگیری می کند [32].

موم زنبور عسل نیز دارای فعالیت ضد میکروبی گزارش شده است [33] اما مطالعات مرتبط به آن بسیار محدود است. گرده جمع‌آوری‌شده توسط زنبور (BCP) و نان زنبور (BB) عمدتاً به دلیل ارزش غذایی بالای خود مورد توجه قرار می‌گیرند. هر دو محصول سرشار از پروتئین، اسیدهای آمینه ضروری، قندها، اسیدهای چرب (از جمله اسیدهای چرب ω-3 و ω-6)، ویتامین‌ها، عناصر ماکرو و میکرو هستند. علاوه بر این، آنها به عنوان غذاهای کاربردی در نظر گرفته می شوند زیرا سرشار از ترکیبات پلی فنلی هستند و خواص آنتی اکسیدانی قابل توجهی از خود نشان می دهند. آنها همچنین حاوی طیف گسترده ای از ترکیبات مفید برای سلامتی هستند که در غذاهای کاربردی وجود دارند، مانند پری بیوتیک ها، پروبیوتیک ها، فیبر، لیگنان ها، تری ترپن ها، کاروتنوئیدها، پپتیدهای فعال زیستی و اسیدهای آلی [34، 35، 36، 37]. مکمل های غذایی دام و طیور با BCP باعث افزایش عملکرد رشد، پاسخ های ایمنی و کیفیت لاشه می شود و جایگزین عالی برای آنتی بیوتیک ها در نظر گرفته می‌شود [38]. در بسیاری از کشورها، این محصولات در درمان با محصولات زنبور عسل یا انواع دیگر طب مکمل برای طیف وسیعی از بیماری ها استفاده می شود [36، 39، 40].

گرده تنها منبع پروتئین و چربی و منبع اصلی عناصر ماکرو و میکرو برای کلنی زنبور عسل است، در حالی که شهد یا عسلک (که فرآوری و به عنوان عسل ذخیره می شود) منبع اصلی کربوهیدرات ها است [41]. مقادیر کمتری گرده در مقایسه با عسل در کلنی ذخیره می شود و در دوره های کمبود علوفه یا عدم وجود آن به سرعت تخلیه می شود [42، 43]. یک کلنی می تواند 10 تا 26 کیلوگرم گرده در سال جمع آوری کند [44].

اصطلاح “نان زنبور” به گرده جمع آوری شده ای اطلاق می شود که توسط زنبورها فرآوری، تخمیر و در کندو ذخیره می شود. زنبورهای کارگر که برای جمع‌آوری علوفه فعالیت می‌کنند، دانه های گرده را که به کندو بازگردانده‌اند، مستقیماً در سلول های خالی کندو، بین سلول‌های نوزادان و سلول‌های عسل تخلیه می کنند و در نتیجه یک نوار مشخص از نان زنبور را تشکیل می دهند که برای مصرف فوری توسط زنبورهای پرستار در دسترس است. زنبورهای کارگر از شهد قی شده برای چسباندن دانه های گرده به یکدیگر استفاده می کنند و در نتیجه گرده گلوله را تشکیل می دهند. سپس زنبورهای میانسال عسل و ترشحات غدد را اضافه و آن را محکم در داخل سلول شانه فشرده می‌کنند و با سر خود فشار می‌دهند. فرض بر این است که تخمیر این مخلوط و احتمالاً پیش هضم دانه های گرده توسط آنزیم های اضافه شده توسط زنبورها و همچنین میکروبیوم نان زنبور، باعث حفظ نان و ارتقای ارزش غذایی آن می شود [45]. جوامع میکروبی نان زنبور می توانند ترکیبات ضد میکروبی خود را تولید کنند و در نتیجه به فعالیت زیستی آن کمک کنند.

BCP فعالیت ضد باکتریایی و ضد قارچی، حداقل به صورت آزمایشگاهی، از خود نشان می دهد [46، 47، 48]. اطلاعات به ‌طور قابل ‌توجهی درباره نان زنبور کمتر است، اما با این وجود ثابت شده است که فعالیت ضد میکروبی قابل توجهی از خود نشان می دهد [35، 49، 50].

اگرچه بیشتر ترکیبات ضد میکروبی محصولات زنبور عسل شناسایی شده اند (جدول 1)، مکانیسم عمل آنها هنوز به طور کامل مشخص نشده است. به طور مشابه، سهم میکروبیوم در فعالیت ضد میکروبی اعمال شده توسط محصولات زنبور عسل، باید به تفصیل روشن شود.

جدول 1. ترکیبات محصولات زنبور عسل که فعالیت ضد میکروبی از خود نشان می دهند.

این بررسی در صدد است تا یافته‌های پژوهشی به‌روز در مورد فعالیت ضد میکروبی گرده و نان زنبور، و همچنین چالش‌های کنونی و چشم‌اندازهای آتی در این زمینه را ارائه دهد.

2. ترکیب فیزیکوشیمیایی گرده جمع‌آوری‌شده توسط زنبور (BCP) و نان زنبور (BB)

ترکیب شیمیایی گرده زنبور عسل به شدت به منشاء گیاهی و جغرافیایی، آب و هوا، نوع خاک، فصل و شرایط آب و هوایی در طول جمع آوری، و همچنین به نژاد زنبور عسل و حتی شیوه‌های زنبورداری بستگی دارد [70، 71]. مطالعات مختلف بررسی شده توسط Campos و همکاران [72] نشان داده است که زنبورها هنگام جمع‌آوری گرده بسیار انتخابی هستند و عمده گرده جمع‌آوری‌شده از چند گونه گیاهی خاص به دست می‌آید. شناسایی منشا گیاهی BCP و BB از اهمیت بالایی برخوردار است زیرا خواص بیولوژیکی، تغذیه ای، آنتی اکسیدانی و ضد باکتریایی آنها مستقیماً به ترکیب آنها مربوط می شود [73، 74].

لازم به ذکر است که اندازه‌گیری‌های مواد مغذی خام در BCP و BB نمی‌تواند ارزش غذایی یا آنتی اکسیدانی آن‌ها را برای زنبورهای عسل یا مصرف‌کنندگان انسانی به طور دقیق تعیین کند. زیست‌فراهمی مواد مغذی حائز اهمیت است، به‌ویژه با در نظر گرفتن این واقعیت که این مواد مغذی درون دانه‌های گرده با قابلیت شکسته شدن سخت، محصور شده‌اند. دیواره های بیرونی دانه گرده از دو لایه تشکیل شده است: بیرونی ترین لایه (exine) از یک بیوپلیمر مقاوم به نام اسپوروپولنین ساخته شده است در حالی که سطح داخلی (intine) از میکروفیبریل های سلولزی الاستیک و پکتین تشکیل شده است [75]. به همین دلیل ممکن است ارزیابی تأثیر رژیم‌های غذایی BCP یا BB بر زنبورهای عسل و انسان‌ها مناسب‌تر باشد [76].

پیشنهاد می شود که شکستن دانه های گرده به طور طبیعی در طول تخمیر BCP که توسط آنزیم ها و میکروارگانیسم های زنبور عسل (باکتری ها، کپک ها و مخمرها) کاتالیز می شود، اتفاق می افتد. نان زنبور در مقایسه با BCP برای زنبورها مغذی تر است [77، 78].

میکروبیوم نان زنبور نقش محوری در تغذیه و رشد زنبورهای عسل ایفا می کند [79، 80]. چندین مطالعه نشان داده اند که میکروارگانیسم های نان زنبور، عمل پیش هضم آنزیمی دانه های گرده را تسهیل می کنند [45، 48، 79]، بنابراین محتوای مواد مغذی و قابلیت هضم آنها را افزایش می دهند [81، 82]. Vasquez and Olofsson پیشنهاد کردند که باکتری های اسید لاکتیک از معده زنبور عسل در تخمیر نان زنبور نقش دارند و ممکن است با تولید ویتامین ها مسئول بهبود ارزش غذایی آن باشند [80].

از سوی دیگر، اندرسون و همکاران کاملاً با این ایده که پیش هضم میکروبی گرده یا تبدیل مواد مغذی در طول بلوغ نان زنبور اتفاق می‌افتد، مخالف بودند [83]. علاوه بر این، نیکلسون و همکاران [84] به کارگران جوان درون قفس، گرده تازه و ذخیره شده دادند. او مشاهده کرد که قابلیت هضم گرده بالا بوده و ذخیره گرده آفتابگردان قابلیت هضم آن را افزایش نداده است، بنابراین پیشنهاد کرد که ذخیره‌سازی گرده فواید آشکاری برای زنبورهای عسل ندارد.

این واقعیت که زنبورها از نان زنبور ذخیره شده در اوایل بهار برای تغذیه اولین نوزادان بعد از زمستان گذرانی استفاده می کنند، به نفع ارزش غذایی بالاتر آن است. علاوه بر این، Beutler و Opfinger مشاهده کردند که زنبورهایی که با نان زنبور تغذیه می شدند در مقایسه با زنبورهایی که با گرده جمع آوری شده از تله ها تغذیه می شدند، عمر طولانی تری داشتند [85]. با این حال، کارول و همکاران مشاهده کردند که احتمال مصرف گرده دو تا چهار روزه به جای گرده هفت روزه بیشتر است [86]. علاوه بر این، کارگران جوانی که به مدت 7 روز با گرده ذخیره‌شده 1 روزه، 5 روزه یا 10 روزه پرورش داده شدند، هیچ تفاوتی در وزن بدن، تجمع مدفوع در روده‌های عقبی، یا سطوح پروتئین غده هیپوفارنکس نشان ندادند، که نشان می‌دهد سن گرده ارتباطی به ارزش غذایی آن ندارد [86].

اینکه آیا تخمیر و یا ذخیره‌سازی گرده بر ارزش غذایی و خوش‌خوراکی گرده برای زنبورها تأثیر می‌گذارد یا خیر، تا به امروز بحث‌برانگیز باقی مانده است. با این وجود، یک مطالعه اخیر یک مفهوم جدید و جالب را ارائه می دهد: هنگامی که لاروهای زنبور، نان زنبور را مصرف می کنند، هم بیوماس میکروبی و هم گیاهی را مصرف می کنند و اسیدهای آمینه میکروبی و همچنین اسیدهای آمینه با منشاء گیاهی (گرده) را جذب می کنند که این امر زنبورها را به جای گیاهخوار، همه چیز خوار می کند [87]. دارمپال و همکاران همچنین مشاهده کردند که میکروب‌های گرده، تغذیه قابل توجهی را برای لاروهای زنبور ماسون فراهم می‌کنند [82]. آنها پیشنهاد کردند که جوامع میکروبی مرتبط با گرده پیر برای سلامت زنبورها مهم هستند، نه تنها به عنوان هم‌زیست‌ تغذیه‌ای، بلکه به عنوان یک جزء اصلی رژیم غذایی نیز عمل می‌کنند.

رطوبت برای BCP بین 21.7 تا 27 درصد متغیر است، در حالی که محدوده وسیع‌تری برای مقادیر رطوبت نان زنبور مشاهده می‌شود: 11.41 تا 28 درصد [88، 89]. محتوای پروتئین بین 7 تا 40 درصد گرم در 100 گرم BCP و 14 تا 37 درصد برای نان زنبور تعیین شد [90،91،92]. به گفته Nagai و همکاران [92]، نان زنبور حاوی مقادیر زیادی (20٪) پروتئین به راحتی قابل جذب و تمام اسیدهای آمینه ضروری برای انسان است. این مواد عبارتند از اسید گلوتامیک، اسید آسپارتیک، پرولین (فراوان ترین اسید آمینه)، آرژنین، والین، هیستیدین، لوسین، ایزولوسین، لیزین، متیونین، تریپتوفان، فنیل آلانین، ترئونین، سیستئین، تیروزین، آلانین، گلیسین و سرین [93]. آنزیم های موجود در نان زنبور شامل آمیلاز، اینورتاز، ترانسفراز فسفاتاز و گلوکز اکسیداز می باشد. کوفاکتورهای آنزیمی نیز در نان زنبور یافت می شوند، از جمله بیوتین، گلوتاتیون، NAD و برخی نوکلئوتیدها [94]. Anđelković و همکاران [95] نمونه‌های BCP و BB مشتق شده از همان کلنی‌های زنبور عسل را مقایسه کردند. آنها دریافتند که محتوای پروتئین خام در نان زنبور در مقایسه با BCP تا 19.91 درصد افزایش یافته است.

کربوهیدرات های موجود در BCP بین 24 تا 60 گرم در 100 گرم و در نان زنبور بین 24 تا 35 گرم در 100 گرم متغیر بود [92، 93، 96]. Bakour و همکاران [35] کربوهیدرات های نان زنبور را تا 74.82 ± 0.04 گرم در 100 گرم اندازه گیری کردند و قندهای آزاد اصلی شناسایی شده فروکتوز (11.8 ± 0.6 گرم در 100 گرم نان زنبور)، گلوکز (5.7 ± 0.4 گرم در 100 گرم نان) و ترهالوز (0.92 ± 0.01 گرم در 100 گرم نان زنبور) بودند. نان زنبور در مقایسه با گرده حاوی نشاسته کمتری است [88]. طبق گفته Roulston و Cane [76]، محتوای نشاسته در گرده از 0 تا 22 گرم در 100 گرم متغیر بود. Anđelković و همکاران [95] محتوای سلولز را در BCP (3.7 گرم در 100 گرم) و نان زنبور (2.7 گرم در 100 گرم) تعیین کردند. در طول تخمیر گرده که در سلول‌های شانه انجام می‌شود، کربوهیدرات‌ها توسط گونه‌های Lactobacillus متابولیزه شده و اسید لاکتیک تا 3.2 درصد تولید می‌شود [92، 93]. محدوده pH گرده زنبور از 3.8 تا 6.3 و pH نان زنبور از 3.8 تا 4.3 می باشد [88، 90، 93].

لیپیدها در BCP بین 1 تا 13 گرم در 100 گرم [97] و در نان زنبور بین 6 تا 13 گرم در 100 گرم [92] متغیر بود. Bakour و همکاران [35]، مقدار کل لیپیدهای نان زنبور را 1.90 ± 0.06 گرم در 100 گرم نان زنبور گزارش کردند. Kaplan و همکاران [89] میزان چربی را در نان زنبور بین 5.93 گرم در 100 گرم نان زنبور و 11.55 گرم در 100 گرم نان زنبور تخمین زدند. Zuluaga و همکاران [91] پانزده نمونه نان زنبور را تجزیه و تحلیل کردند و محتوای لیپید را بین 1.65 تا 5.50 گرم در 100 گرم (میانگین 3.40 ± 1.08 گرم در 100 گرم) تعیین کردند. تفاوت های مشاهده شده را می توان به منشا گیاهی نان زنبور نسبت داد. Anđelković و همکاران [95] گزارش کردند که میزان چربی خام در نان زنبور 4.47 درصد بیشتر از BCP است.

حداقل 14 اسید چرب (FAs) در نمونه‌های BCP از رومانی، لهستان، کره جنوبی و چین شناسایی شد که فراوان‌ترین آن‌ها اسیدهای α-لینولنیک، پالمیتیک و لینولئیک بودند [74، 98]. Kaplan و همکاران [89]، 37 اسید چرب را در 8 نمونه نان زنبور از ترکیه شناسایی کردند و دریافتند که نسبت اسیدهای چرب اشباع نشده به اشباع بین 1.38 تا 2.39 است، که نشان می‌دهد نان زنبور منبع خوبی از اسیدهای چرب غیراشباع است.

اسیدهای چرب، مواد مغذی مهمی هستند که نقش عمده ای در باروری و سلامت زنبور عسل دارند [99]. اسیدهای چرب غیراشباع چندگانه به ویژه امگا 3، در تغذیه و سلامت انسان نیز مهم هستند زیرا سطح تری گلیسیرید و کلسترول خون را کاهش می دهند [100]. علاوه بر این، آنها خواص ضد التهابی و ضد ترومبوتیک از خود نشان می دهند [101]. اسیدهای چرب امگا 3 نیز در پیشگیری و درمان سرطان نقش دارند [102]. اسیدهای چرب به عنوان عوامل ضد میکروبی شناخته شده اند [67، 68].

اسیدهای آلی مانند اسیدهای استیک، سیتریک، لاکتیک، مالیک، اگزالیک، تارتاریک، سوکسینیک و اسید گلوکونیک که فراوان ترین آنهاست، در BCP یافت می شوند [36].

BCP حاوی ویتامین های محلول در آب مانند ویتامین های گروه B، ویتامین C، روتین و اینوزیتول و همچنین ویتامین های محلول در چربی از جمله A (عمدتاً بتاکاروتن)، E و D است [103، 104]. نان زنبور سرشار از ویتامین های گروه B و ویتامین K است که در گرده تازه وجود ندارد [105، 106]. بر اساس مقاله Hryniewick و همکاران [107]، نان زنبور سرشار از آلفا توکوفرول (80 ± 30 میکروگرم در گرم) است و حاوی مقادیر نسبتاً کمی (11.5 ± 0.3 میکروگرم در گرم) از کوآنزیم Q10 است که یکی از مهمترین آنتی اکسیدان های سلولی است [108].

علاوه بر این، گرده حاوی بیش از 25 عنصر میکرو و ماکرو مختلف مانند آهن، کلسیم، فسفر، پتاسیم، مس، روی، سلنیوم و منیزیم است [40]. مواد معدنی غالب در نان زنبور، پتاسیم و پس از آن فسفر، کلسیم، منیزیم، آهن، سدیم، روی و منگنز بود [35]. خاکستر بر پایه ماده خشک در BCP به مقدار 2.5 ± 0.4 گرم تعیین شده است [90]. خاکستر در نان زنبور بین 1.9 تا 2.54% [89] و 3.32 ± 0.08% [35] بود. Anđelković و همکاران [95] گزارش کردند که محتوای خاکستر در نان زنبور در مقایسه با BCP تا 7.54 درصد افزایش یافته است. علاوه بر این، میزان کلسیم، پتاسیم، فسفر، منیزیم و آهن در مقایسه با BCP افزایش یافته در حالی که روی و منگنز کاهش یافته است. این می‌تواند ناشی از متابولیسم میکروبی باشد که در طی تخمیر گرده به نان زنبور اتفاق می‌افتد [109، 110].

Vanderplanck و همکاران [111]، ترکیبات استرولی را در BCP مشتق شده از بسیاری از گونه‌های گیاهی (Calluna vulgaris L. Hull، Cistus spp.، Cytisus scoparius (L.) Link، Salix caprea L.، and Sorbus aucuparia L.) شناسایی کردند. فیتواسترول‌های اصلی شامل β-sitosterol و δ5-avenasterol بودند. مقادیر قابل توجهی از δ7-avenasterol (در C. vulgaris، 20.23%) و کسری 24-methylenecholesterol/campesterol (در S. aucuparia L.، 84.07%) در چندین نمونه گرده اندازه‌گیری شد. فیتواسترول ها پتانسیل درمانی دارند: آنها باعث آپوپتوز سلولی می‌شوند، سطح کلسترول را کاهش می دهند و فعالیت محافظت کننده قلبی و ضد التهابی را اعمال می کنند [112، 113، 114].

ترکیبات پلی فنول رنگ مشخصی به دانه های گرده می دهند (زرد، قهوه ای، سیاه، قرمز، بنفش و غیره) و ویژگی ارگانولپتیک مشخص آن طعم تلخ است [115]. پلی فنول ها به عنوان آنتی اکسیدان های موثر، به پیشگیری از سرطان [116، 117، 118] و درمان دیابت [119، 120]، آترواسکلروز [121] و بیماری های قلبی عروقی [122]، بیماری های خود ایمنی [123] و حتی زوال عقل [120، 124] کمک می کنند. آنها همچنین فعالیت ضد میکروبی قوی از خود نشان می دهند [62، 63]. ترکیبات پلی فنلی گرده از نظر شیمیایی با عنوان فلاونوئیدها و اسیدهای فنولیک مشخص می شوند. چندین نویسنده حلال‌های استخراجی مختلفی مانند متانول، اتانول، هگزان یا آب را آزمایش کردند تا تأثیر آنها بر غلظت ترکیبات فعال زیستی و همچنین خواص فعال زیستی BCP و BB را ارزیابی کنند [71].

در نمونه‌های BCP با منشاء گیاهی متنوع، تریستین، لوتئولین، سلاژین، میریستین، رامنتین، ایزورامنتین، ایزوکوئرستین، کاتچین، ناریگنین، آپیژنین، کوئرستین و کامفرول، فلاونوئیدهای شناسایی‌شده هستند. دو مورد آخر و اشکال گلیکوزیدی آنها فراوان ترین هستند [36، 125، 126]. سایر فلاونوئیدهای موجود در گرده زنبور عسل عبارتند از لوکوآنتوسیانیدین ها و کاتچین ها [127].

اسیدهای فنولیک موجود در BCP عبارتند از اسید سیرینگیک، کوماریک، سیناپیک، فرولیک، سینامیک، کلروژنیک، گالیک و آبسزیک [126، 127، 128]، اسیدهای کافئیک [129]، و همچنین هیدروکسی سینامیک، ارتو-کوماریک و پاراکوماریک [128، 130، 131].

مطالعات مرتبط با نان زنبور کمتر وجود دارد. Isidorov و همکاران [34]، با استفاده از GC-MS، نارینگنین، کامفرول، آپیژنین، ایزورامنتین، و کوئرستین را به عنوان فلاونوئیدهای اصلی، و اسید p-کوماریک را به عنوان اسید فنولیک اصلی در نمونه های نان زنبور از لتونی، روسیه و لهستان گزارش کردند. Markiewicz-Zukowska و همکاران [116]، سه نمونه نان زنبور از لهستان را با استفاده از GC-MS تجزیه و تحلیل کردند و کامفرول و آپیژنین را به عنوان فلاونوئیدهای اصلی تعیین کردند. Tavdidishvili و همکاران [132]، وجود 12-15 فلاونوئید را با HPLC در نمونه های نان زنبور از گرجستان شناسایی کردند. که فراوان ترین آنها نارنجین، روتین و کوئرستین (20 درصد از کل محتوای فلاونوئیدی) بودند. Sobral و همکاران [117]، شش نمونه نان زنبور از پرتغال را تجزیه و تحلیل کردند و گزارش کردند که ترکیبات فنلی اصلی کوئرستین، کامفرول، میریستین، ایزورامنتین و مشتقات گلیکوزید هرباستین هستند. Bakour و همکاران [35]، ترکیب فنلی یک نمونه نان زنبور مراکشی را تجزیه و تحلیل کردند و وجود سیزده ترکیب پلی فنلی را گزارش کردند که فراوان‌ترین آنها کوئرستین، کامفرول، ایزورامنتین و مشتقات گلیکوزید متیل هرباسترین بودند.

Urcan و همکاران [71] نتیجه گرفتند که داده های متون علمی نشان می دهد که تنوع گسترده ای در مورد محتوای ترکیبات فنلی در نان زنبور احتمالاً به دلیل منشا گیاهی متنوع وجود دارد. با این حال، این تنوع را می‌توان به روش‌های مختلف استخراج و کمّی‌سازی که در مطالعات مختلف اجرا شده‌اند، نسبت داد.

یک مطالعه اخیر منتشر شده توسط Urcan و همکاران [133]، با مقایسه نمونه های گرده، BCP و نان زنبور از رومانی و هند، نشان داد که مشخصات فنلی نان زنبور با مشخصات گرده گیاهان جمع آوری شده دستی و همچنین گرده جمع آوری شده توسط زنبورها یکسان است. آنها گزارش کردند که علیرغم تغییرات بیوشیمیایی که ممکن است در طی تخمیر BCP به نان زنبور صورت گیرد، ترکیبات فنلی تحت تأثیر قرار نگرفتند. علاوه بر این، این محققان همچنین گزارش دادند که عواملی مانند خاک و آب و هوا ممکن است بر ترکیبات فنلی در نمونه های مورد مطالعه تأثیر نگذارد. جدیدترین مطالعه نشان داد که کل محتوای فنلی و فلاونوئیدی و همچنین فعالیت پاکسازی رادیکال های آزاد در BCP چند گُله، 1.27 تا 2.40 برابر افزایش یافته است که به دنبال تخمیر خود به خودی یا تخمیر با استفاده از Lactococcus lactis و Lactobacillus rhamnosus به عنوان تلقیح انجام شد [48].

در خاتمه لازم به ذکر است که ترکیب شیمیایی BCP و نان زنبور بسته به منشا گیاهی آنها بسیار متفاوت است. تغییرات گسترده هم از نظر ترکیب و هم از لحاظ غلظت اجزا در BCP و نان زنبور را می توان به پیش هضم احتمالی دانه های گرده در طی تخمیر BCP به نان زنبور نسبت داد. علاوه بر این، ویتامین ها، اسیدهای آمینه و سایر مواد مغذی ممکن است توسط میکروبیوم نان زنبور تولید شوند. نشانه‌هایی وجود دارد که نشان می‌دهد نگهداری نان زنبور به دلیل سیلاژ ساده نیست و مطالعات بیشتری در مورد این جنبه باید در آینده انجام شود.

نمونه برداری بسیار مهم است، به خصوص زمانی که نمونه ها از محصولات موجود در بازار گرفته می شوند و مستقیماً از کندوی زنبور عسل تهیه نمی شوند. شرایط نگهداری ممکن است کیفیت نمونه را کاهش دهد. مطالعات مقایسه ای بیشتر با استفاده ازنمونه های BCP و نان زنبور گرفته شده از یک کندو در یک زمان، می‌تواند به طور قطعی نشان دهد که تاچه اندازه، نان زنبور از نظر تغذیه ای نسبت به BCP غنی تر است.

3. میکروبیوم BCP و نان زنبور

پیشنهاد شده است که زنبورها از زنبورهای گوشتخوار باستانی در اواسط تا اواخر دوره کرتاسه با به دست آوردن میکروبیوم روده‌ای تخصصی گرده خوار تکامل یافته‌اند که به آنها اجازه داده است تا از رژیم گیاهخواری تغذیه کنند [134]. این جوامع باکتریایی اجدادی دیگر بخشی از میکروبیوم اصلی روده Apis mellifera نیستند [135]. زنبورهای کارگر بالغ A. mellifera در عصر مدرن میزبان یک میکروبیوم روده مشخص از نه نوع باکتریایی متمایز هستند که بیش از 95 درصد از کل تنوع باکتریایی را تشکیل می‌دهند. این یافته ها در چندین مطالعه گزارش شده است که نمونه های به دست آمده از محیط های مختلف، قاره ها و ژنوتیپ های میزبان را تجزیه و تحلیل می کند [135، 136، 137، 138]. نان زنبور، منبع اصلیغذای نوزادان، فاقد گونه‌های باکتریایی است که معمولاً در میکروبیوم کارگران بالغ وجود دارند [139]. Saraiva و همکاران [79]، تنوع و ساختار جامعه باکتری‌ها و آرکیاها را در روده زنبور عسل آفریقایی و نان زنبور ارزیابی کردند و مشاهده کردند که تنها 7 درصد از گونه های موجود در هر دو گروه دیده می شود.

وضعیت سلامتی زنبورهای عسل انفرادی و کلنی به عنوان یک کل به روابط همزیستی با میکروبیوم روده بستگی دارد [140، 141، 142]. میکروبیوم روده در هضم گرده، استفاده ازکربوهیدرات‌ها و پاسخ ایمنی دخیل است [143، 144]. در همین راستا، Rokop و همکاران [145]، از روش‌شناسی مبتنی بر کشت و تاکسونومی مولکولی (توالی یابی ژن rRNA 16S) برای شناسایی جوامع باکتری‌های اسید لاکتیک (LAB) موجود در محیط های کندوی زنبور عسل استفاده کردند. در این فرآیند، آنها برهکنش‌هایی را بین اعضای باکتریایی غیر اصلی (Fructobacillus spp. و Lactobacillaceae) و اعضای اصلی مخصوص زنبور عسل شناسایی کردند. هم Fructobacillus spp. و Lactobacillaceae سلول های نوزادان، نان زنبور، و شهد را کلنی می کنند و ممکن است گونه های پیشگام باشند که محیطی مساعد برای تلقیح توسط باکتری های اصلی زنبور عسل ایجاد می کنند. سنجش‌های هم‌کشت نشان داده‌اند که این باکتری‌ها رشد گونه‌های باکتریایی خاص زنبور عسل را افزایش می‌دهند. جالب توجه است که محصولات فرعی Fructobacillus spp. در محیط مصرف‌شده از رشد کلاد اختصاصی Firm-5 زنبور عسل به صورت آزمایشگاهی پشتیبانی کردند. مشخص کردن متابولیکی Fructobacillus با استفاده از سنجش های استفاده‌از کربوهیدرات نشان داد که این گونه قادر به استفاده از قندهای ساده‌ای مانند فروکتوز و گلوکز و همچنین کربوهیدرات گیاهی پیچیده لیگنین است.

Manirajanو همکاران [146] فراوانی، تنوع و ساختار جامعه باکتریایی را در گرده‌های غان، چاودار، کلزا و زعفران پاییزه با استفاده از کشت، توالی‌یابی و میکروسکوپ بررسی کردند. Proteobacteria فراوان‌ترین شاخه در همه گونه‌های گرده بود و به دنبال آن Actinobacteria، Acidobacteria و Firmicutes قرار داشتند. بر اساس این مطالعه، جوامع میکروبی گونه‌های گیاهی گرده افشانی‌شونده توسط حشرات در مقایسه با گونه‌های گرده افشانی‌شونده توسط باد مشابهتر بودند، و نشان می دهد که حشرات جوامع میکروبی را شکل می دهند. Ushio و همکاران [147]، فرض کردند که بخشی از جامعه میکروبی روی سطح یک گل از سطح بدن حشرات به آنجا منتقل می‌شود و این جامعه می‌تواند اطلاعاتی برای شناسایی حشرات گرده افشان بالقوه آن گیاه ارائه کند. برای آزمایش این فرضیه،آزمایش‌های آزمایشگاهی نشان دادند که ترکیب جامعه میکروبیروی سطح گل در واقع پس از تماس با یک حشره تغییر کرد و نشان داد که میکروب‌ها از حشره به گل منتقل می‌شوند.

Gilliam نمونه‌های گرده، BCP و نان زنبور با سنین مختلف را که همه از یک گونه گیاهی مشتق شده بودند، تجزیه و تحلیل کرد و نشان داد که تغییرات درترکیب بیوشیمیایی و میکروبیولوژیکی گرده گل به محض جمع آوری توسط زنبور عسل شروع می‌شود [45].

علاوه بر این، Gilliam گزارش داد که میکروب‌های غالب در گرده و نان زنبور قارچ بودند (55 درصد از کل جدایه های گرده و 85 درصد از کل جدایه های نان زنبور). باکتری‌ها تا 49 درصد در گرده وجود داشتند که درBCP به 28 درصد کاهش یافتند و تنها 4 درصد میکروبیوتای نان زنبور را تشکیل می دادند. سرده باسیلوس نماینده 2 درصد از میکروب‌های گرده، 20 درصد از میکروب‌های BCP و 11 درصد از میکروب‌هاینان زنبور بودند. Bacillus subtillis، تنها سرده Bacillus مرتبط با گرده گل، در BCP و نان زنبور یک هفته ای فراوان‌تر بود [148]. در مورد کپک‌ها، Penicillia، Mucorales و Aspergilli فراوان‌ترین بودند.

Vasquez و Olofsson [80]، حضور LAB های قبلاجداشده از معده زنبورعسل را درنمونه‌های BCP، نان زنبور دو هفته‌ای و نان زنبور دو ماهه بررسی کردند. جامعه LAB شامل دوازده گونه متعلق به Lactobacillus و Bifidobacterium [80، 138] بود. اکثر این گونه ها در BCB ونان زنبور دو هفته‌ای زنده بودند، اما درنمونه های نان زنبور قدیمی‌تراصلاً زنده نبودند. نویسندگان اینگونه بیان کردند که LABs در واقع توسط زنبورهایی که شهد را پس می‌زنند، به BCP تلقیح می‌شوند. LAB‌ها را می‌توان به عنوان یک کشت آغازین درتخمیر BCP درنظرگرفت. علاوه بر این، ترکیبات ضد میکروبی تولید‌شده توسط LABs می‌توانند نان زنبور راحفظ کنند و از زنبورهای عسل دربرابر بیماری‌ها محافظت کنند [80].

Mattila و همکاران [149]، تنوع باکتریایی را درنمونه های روده زنبورعسل ونان زنبور ارزیابی کردند. Succinivibrio، Oenococcus، Paralactobacillus، و Bifidobacterium گونه های غالب یافت شده درنمونه های روده زنبور بودند که بیش از67 درصد از جوامع باکتریایی آن را تشکیل میدادند. دو شاخه باکتریایی (Proteobacteria و Firmicutes) درنمونه‌هاینان زنبور شناسایی شدند، در حالی که فراوان‌ترین جنس‌ها Oenococcus بودند و پس ازآن Paralactobacillus، Shimazuella و Saccharibacter قرار داشتند. از میان 18 گونه شناسایی‌شده درنان زنبور، 17 گونه بی هوازی اختیاری یا اجباری بودند. این گونه ها شامل بسیاری از LAB ها مانند Oenoccoccus، Paralactobacillus، Bifidobacterium وهمچنین Enterobacteria (Enterobacter، Escherichia، Shigella، Klebsiellaو Serratia) بودند. نویسندگان پیشنهاد می‌کنند که نان زنبور با توجه به کشش اکسیژن لایه‌بندی می‌شود، که ممکن است به آن اجازه دهد از طیف وسیعی از باکتری ها، از هوازی ها تا بی هوازی های اجباری پشتیبانی کند.

Anderson و همکاران [83]، سنجش‌های رفتاری، سنجش‌های شمارش باکتری، میکروسکوپی و توالی‌یابی پیرو ژن rRNA 16S را برای روشن کردن ساختار جوامع باکتریایی در نمونه‌های BCP و نان زنبور انجام دادند. آنها دریافتند که گرده تازه جمع‌آوری‌شده حاوی باکتری کمی است و این تعداد در گرده ذخیره‌شده پس از 96 ساعت کاهش می‌یابد. زیر مجموعه کوچکی از باکتری ها بدون توجه به فصل در هر دو گرده تازه جمع‌آوری‌شده و ذخیره‌شده وجود داشتند که نشان دهنده ارتباط با باکتری های موجود در کندو است. جوامع باکتریایی نان زنبور بسیار متفاوت از جوامع باکتریایی موجود در روده زنبور عسل یا آنهایی بود که روی سطح بدن زنبورهای علوفه جوی یافت شد. باکتری‌های اصلی روده زنبور در گرده‌های تازه جمع‌آوری‌شده با فراوانی نسبی بیشتری نسبت به گرده‌های ذخیره‌شده یافت شدند. نمونه‌های نان زنبور سه برابر تعداد توالی‌های باکتریایی منحصربه‌فرد درمقایسه با گرده‌های تازه جمع‌آوری‌شده داشتند که از میان آنها Bradyrhizobiaceae، Xanthomonadaceae، Enterobacteriaceae، Rhodobacterales، Pseudomonadales، باکتروئیدها و بسیاری از گروه‌های اکتینوباکتری ها بودند. حداقل دو میکروب مقاوم به اسید و اسمز، Lactobacillus kunkeei و Parasaccharibacter apium، به نسبت بالایی درنان زنبور وجود داشتند. دراین مطالعه، Anderson و همکاران روش‌های متعددی را برای نشان دادن اینکه هیچ تبدیل مواد مغذی یا پیش هضم توسط میکروب ها درطی تبدیل BCP بهنان زنبور انجام نمی‌شود، اجرا کردند. که به نوبه خود نشان می‌دهد که عسل اضافه شده، شهد، ترشحات زنبورعسل و ترکیبات ضد میکروبی خود گرده می‌توانندنان زنبور را حفظ کنند.

درمطالعه‌ای توسط Asama و همکاران [150]، Lactobacillus با فراوانی (83.9 درصد) درنان زنبور و (74.6 درصد) درسایرنمونه های ژاپنی به عنوان جنس غالب یافت شد و پس از آن Burkholderia (2.1 درصد) درنان زنبور و Gluconobacter (3.4 درصد) و Paenibacillus (2.1 درصد) درنمونه‌های BCP بودند. Lactobacillus kunkeei فراوان‌ترین گونه از تمام سویه های Lactobacillus (99.5 درصد درنان زنبور و 98.6 درصد درBCP) و همچنین درعسل، ژل رویال و معده زنبور عسل بود.

Donkersleyو همکاران [151]، بااستفاده از توالی‌یابی نسل بعدی (Illumina MiSeq) والکتروفورزژل با گرادیان دناتوره کننده (DGGE)،تنوع میکروبی نمونه‌هاینان زنبور از شمال غربی انگلستان راارزیابی کردند. تجزیه و تحلیل، 24 شاخه باکتریایی را نشان داد که Proteobacteria شایع ترین شاخه بود. همه نمونه‌هاینان زنبور بطورمتوسط 13 شاخه باکتریایی راشامل میشد که فراوان ترین آنها باکتروئیدها، Firmicutes، α-Proteobacteria، β-Proteobacteriaو γ-Proteobacteria بودند. Enterobacteriaceae فراوان ترین خانواده ای بود که درنان زنبور یافت شد. بطورمتوسط 96 جنس باکتریایی درهرنمونه نان زنبور یافت شد و پنج جنس رایج عبارت بودند از:سودوموناس (32.4 درصد)، آرسنوفونوس (13.0 درصد)،لاکتوباسیلوس (8.2 درصد)، اروینیا (7.7 درصد) و آسینتوباکتر (5.2 درصد). یازده جنس درهمه نمونه‌ها یافت شد، ازجمله سودوموناس، آرسنوفونوس، Orb، لاکتوباسیلوس، اروینیا و آسینتوباکتر، که نشان می‌دهد این‌ جنس‌های باکتریایی ممکن است اعضای میکروبیوم اصلی نان زنبور باشند. این مطالعه همچنین تنوع باکتریایی مشاهده‌شده درنان زنبوررا با عوامل محیطی مرتبط کرد، که نشان می‌دهد تغییرکاربری اراضی ممکن است اثرمخرب غیرمستقیمی بر میکروبیوم نان زنبور داشته‌باشد.

Di Cagno و همکاران [152] ساختار جوامع باکتری های اسید لاکتیک در گرده گل پیچک (FP)، BCP، نان زنبور، و روده زنبور عسل را بررسی کردند. آنها نشان دادند که تنوع میکروبی بالای FP و BCP تازه به طور قابل توجهی در نان زنبور کاهش یافت. اکثر گونه‌های LAB در طول بالغ شدن نان زنبور و نان زنبور ذخیره‌شده طولانی‌مدت ناپدید شدند. Lactobacillus kunkeei و Fructobacillus fructosus گونه‌های غالب بودند که در معده زنبور عسل نیز فراوان بودند. محققان سعی کردند تخمیر خودبه‌خودی نان زنبور را با تلقیح BCP با سویه‌های منتخب L. kunkeei و Hanseniaspora uvarum AN8Y27B شبیه سازی کنند. آنها افزایش هضم پذیری و همچنین زیست فرامی مواد مغذی و ترکیبات فعال زیستی طبیعی BCP را نشان دادند. BCP تخمیرشده با استارترهای مخلوط منتخب حاوی غلظت بالاتری از پپتیدها، اسیدهای آمینه آزاد، و فنولیک‌های آزاد بود. علاوه بر این، نسبت به BCP تخمیرشده به‌طور‌خودبخودی، قابلیت هضم پروتئین درون‌تنی بالاتری به نمایش گذاشت. این مطالعه رابطه نزدیک بین باکتری های اسید لاکتیک و مخمرها در طول تخمیر BCP را برجسته کرد.

Disayathanoowat و همکاران [153] جوامع باکتریایی و قارچی را در BCP و نان زنبور دو گونه زنبورعسل، Apis mellifera و Apis cerana، بررسی و مقایسه کردند. دراین‌مطالعه BCP مستقیماً ازپاهای زنبورعسل جمع‌آوری شد. نمونه‌هاینان زنبور پس از 48 و 72 ساعت ازهمان سلول‌های شانه جمع‌آوری شدند. DNA ازنمونه‌ها استخراج شد و سپس منطقه V3-V4 ژن rRNA 16S و همچنین منطقه ITS1-ITS2 قارچی با استفاده از پلت فرم Illumina MiSeq تکثیر و توالی‌یابی شدند. تجزیه و تحلیل، تفاوت معناداری را در میانگین تعداد توالی های باکتریایی و قارچی در نان زنبور بین دو گونه زنبور عسل نشان داد. اگرچه این‌دو گونه ازمنابع گلی متفاوتی استفاده کردند، جوامع میکروبی اصلی مشابه‌ای را با وجود تفاوت فراوانی نشان دادند. فراوان ترین شاخه باکتریایی درهمه نمونه‌های ترکیبی، Proteobacteria (92.12 درصد) بود که به دنبال آن جمعیت کوچکی از Firmicutes (6.66 درصد) قرارداشت. در BCP از هر دو گونه، Enterobacteriaceae فراوان‌تر بودند. بااین حال، تعداد باکتری ها در نان زنبور ذخیره‌شده در کندو در کمتر از 72 ساعت به طور قابل توجهی کاهش یافت. درابتدا، Escherichia-Shiga فراوان ترین جنس باکتریایی بود، اما سپس نسبت آن به کمتر از 10 درصد از واحدهای عملیاتی طبقه بندی (OTU) کل باکتری‌ها درهمه نمونه‌هاینان زنبور کاهش یافت. الگوی مشابهی برای سودوموناس و پاراکوکوس نیز مشاهده شد. درگرده جمع‌آوری شده توسط A. cerana، جنس‌های Rosenbergeilla و Buttiauxella فراوان‌تر بودند، درحالیکه درگرده جمع‌آوری شده توسط A. mellifera، پاراکوکوس و باکتری‌های اصلی روده زنبورعسل (Bifidobacterium، Gilliamella) بالاتر بودند. شاخه‌های اصلی قارچی Ascomycota (93.55 درصد) و به دنبال آن Basidiomycota (5.65 درصد) بودند. Cladosporium که متعلق به Ascomycota است فراوان‌ترین جنس (52.20 درصد) بود. فقط یک جنس مخمر Basidiomycete، Rhodosporidium، 2.65 درصد از کل جامعه میکروبی را به خود اختصاص داد. در‌این‌مطالعه نشان داده شد که با کاهش pH در نان زنبور، برای تعداد باکتری‌ها نیز همین اتفاق می‌افتد، درحالیکه جمعیت‌های قارچی پایدار باقی می‌مانند. Cladosporium جنس قارچی غالب در داخل سلول های شانه باقی ماند. به گفته محققین، این قارچ رشته‌ای خاص می‌تواند با آزادکردن اسیدهای آلی به حفظ گرده کمک کند، همراه با سایر قارچ‌های رشته‌ای که ممکن است هم باکتری‌های همزیست یا آلوده و هم رشد عوامل بیماری‌زا را مهار کند.

4. روش شناسی مطالعه فعالیت ضد میکروبی BCP و نان زنبور

BCP اغلب با استفاده از تله‌های گرده که در ورودی کندوهای زنبورعسل یا داخل (پایین/بالا) کندو نصب شده اند، جمع آوری می‌شود. در برخی موارد، BCP مستقیماً از پاهای عقبی زنبور جمع‌آوری شده است تا از آلودگی میکروبی جلوگیری شود. علاوه براین، گرده مستقیماً از گل‌ها جمع‌آوری شده است تا با BCP مقایسه شود.

نمونه‌های BCP بعد از جمع‌آوری معمولاً در فریزر (−18 درجه سانتیگراد) نگهداری می‌شوند یا تا حدی خشک می‌شوند و سپس در دمای کمتر از 4 درجه سانتیگراد نگهداری می‌شوند و یا خشک می‌شوند و در یک محل خنک و تاریک نگهداری می‌شوند. BCP خشک شده در مقایسه با BCP تازه، کمتر بازدارنده باکتری ها است [50].

نان زنبور مستقیماً از شانه زنبورعسل استخراج می شود. تخمین سن واقعی نان زنبور در داخل کندو دشوار است، زیرا زنبورهای عسل روزانه از آن تغذیه می‌کنند و ممکن است پس از مصرف آن را دوباره پر کنند و یا نکنند. برای نمونه‌برداری، لازم است یک قاب شانه‌دار یا بخشی از آن در داخل کندو ایزوله شود تا از ذخیره گرده تازه در سلول‌های شانه توسط زنبورها جلوگیری شود [153].

حلال‌های مختلف مورد استفاده برای استخراج در جدول 2 ارائه شده است. متانول و اتانول اغلب استفاده می‌شوند و پس از آن آب است. حلال‌های مورد استفاده ممکن است میل ترکیبی شیمیایی خاصی نسبت به مواد فعال داشته باشند. به عنوان مثال، آب می‌تواند فلاونوئیدها مانند گلیکوزیدهای کوئرستین و کامفرول را با کارایی بیشتری استخراج کند [46].

جدول 2. حلال های مختلف مورد استفاده برای استخراج نمونه های BCP و نان زنبور.

بسته به حلال مورد استفاده، عصاره ها ممکن است حتی در برابر یک سویه باکتریایی، فعالیت ضد میکروبی متفاوتی از خود نشان دهند. علاوه بر این، استفاده از غلظت‌های مختلف حلال می‌تواند منجر به فعالیت ضد میکروبی متفاوت علیه عوامل بیماری‌زا شود [156]. علاوه براین، جداسازی عصاره اولیه با استفاده از حلال های مختلف، اثر ضد میکروبی متفاوتی را بر سویه یکسان نشان داد [163]. همبستگی بین حلال‌های مورد استفاده و فعالیت ضد میکروبی اعمال‌شده به طور گسترده در بخش 5 مورد بحث قرار می گیرد.

علاوه بر موارد فوق، متدهای به کار گرفته شده می‌توانند تفاوت در فعالیت ضد میکروبی BCP و نان زنبور را توجیه کنند. دو روش اصلی آزمایشگاهی برای این منظور استفاده می شود. یکی روش رقت‌سازی مایع و دیگری روش انتشار آگار در چاه (agar well diffusion assay) [164] یا انتشار دیسک (disc diffusion assay) [155] است. عواملی وجود دارند که می‌توانند بر نتیجه این سنجش‌ها تأثیر بگذارند. در روش رقت‌سازی مایع، تماس فوری و نزدیکی بین ترکیبات فعال موجود در عصاره‌های BCP یا نان زنبور و میکروارگانیسم هدف وجود دارد. برعکس، در روش انتشار آگار در چاه، سرعت انتشار مواد فعال ممکن است در آگار کندتر از مایع باشد. این مواد فعال ممکن است به دلیل قطبیت، حلالیت، اندازه یا تمایل به گرفتگی، سرعت انتشار یکسانی در آگار نداشته باشند. با این وجود، انتشار آگار در چاه در برخی موارد ممکن است داده‌های تکرارپذیرتری به دست دهد. در مطالعه‌ای که عصاره‌های BCP شیلیایی را علیه Streptococcus pyogenes I.S.P. 364-00 آزمایش کرد، BCP نمونه‌برداری شده برای سه سال متوالی میانگین قطر ناحیه ممانعت یکسانی را در سنجش انتشار آگار در چاه نشان داد، اما مقادیر حداقل غلظت بازدارنده (MIC) یکسان در سنجش رقت‌سازی مایع، نداشت [126]. با این وجود، تکرارپذیری انتشار آگار در چاه نشان‌دهنده حساسیت بیشتر در مقایسه با سنجش رقت‌سازی مایع نیست. برعکس، سنجش رقت‌سازی مایع با حساسیت بالاتر مشخص می‌شود.

حتی اگر روش آزمایشگاهی مورد استفاده یکسان باشد، نتایج در بین مطالعات مختلف متفاوت است. یک دلیل این است که پس از تبخیر حلال اولیه، ماده خشک باقیمانده اغلب در حلال دیگری حل می شود که در همه مطالعات یکسان نیست، چنین حلال هایی ممکن است دی متیل سولفوکسید (DMSO) [47، 166] یا آب فوق‌خالص [73] باشد. بنابراین، باید اثرات شیمیایی و فیزیکی خاص حلال‌های مورد استفاده بر سیستم غشای سلولی باکتری را در نظر گرفت. این اثرات بین گونه ها و سویه های باکتریایی متفاوت است [173].

برای دستیابی به بهترین استخراج فلاونوئیدها، اسیدهای فنولیک و اسیدهای چرب، دانه گرده سفت و سخت باید شکسته شود و لایه‌های اگزین و اینتین مختل شوند. بنابراین، از حلال‌های آلی، سونیکاسیون و گرما به‌صورت ترکیبی استفاده شده است. چنین فرایند شدیدی ممکن است منجر به نتیجه بهتری با توجه به فعالیت ضد میکروبی و آنتی اکسیدانی، غلظت کل فنولیک یا فلاونوئید شود. با این وجود، مشخص نیست که آیا پلی‌فنول‌ها یا دیگر ترکیبات فعال موجود در عصاره‌های مختلف از طریق هضم دانه‌های گرده به راحتی در دسترس مصرف‌کنندگان هستند. انسان‌ها نمی‌توانند دانه‌های گرده را به طور کامل هضم کنند، بنابراین تخمین زده می‌شود که قابلیت زیست‌فراهمی مواد مغذی 50 درصد یا بیشتر کاهش می‌یابد [37]. قابل تصور است که استخراج با استفاده از آب، جذب مواد مغذی را در طول هضم در بدن انسان بهتر شبیه سازی می‌کند. علاوه بر این، عصاره‌های آبی BCP و نان زنبور خوراکی هستند و آماده استفاده به عنوان مواد غذایی هستند.

5. فعالیت ضد میکروبی BCP و نان زنبور – مکانیسم اثر

مقاومت ضد میکروبی یک تهدید نوظهور جهانی است، بنابراین نیاز زیادی به محصولات ضد میکروبی جدید وجود دارد. هم BCP و هم نان زنبور فعالیت ضد میکروبی از خود نشان می دهند [46، 47، 50]. با این حال، اطلاعات کمی در مورد خواص ضد میکروبی BCP و نان زنبور وجود دارد. جدول 3 و جدول 4 به ترتیب مطالعات مربوط به فعالیت ضد میکروبی BCP و نان زنبور را ارائه می دهند. علاوه بر این، اطلاعاتی در مورد منشا جغرافیایی و تعداد نمونه‌های تجزیه و تحلیل شده در مطالعات مختلف ارایه می کنند.

جدول 3. فعالیت ضد میکروبی نمونه های BCP از کشورهای مختلف

*nd: فعالیت ضد میکروبی شناسایی نشد. nd+: فعالیت ضد میکروبی علیه میکروارگانیسم های آزمایش شده شناسایی نشد: B. cereus، B. subtilis، E. coli، S. typhimurium، S. aureus، Y. enterocolitica، E. faecalis، L. monocytogenes، S. cerevisiae، C. rugose، A. niger و R. oryzae [161]. Com: نمونه های ترکیبی از یک منشاء جغرافیایی mono: درصد بالایی از نمونه منوفلورال (تک‌گُله). r: سویه مقاوم به آنتی بیوتیک. ATCC: مجموعه کشت نوع آمریکایی. NCTC: مجموعه ملی کشت‌های نوع. ESA: Escola Superior Agraria de Braganca. CIP: مجموعه انستیتو پاستور. NRLL: مجموعه فرهنگهای خدمات تحقیقات کشاورزی CCM: مجموعه میکروارگانیسم های چک. ISP: پروژه همکاری بین المللی برای توصیف و ذخیره سازی کشت های نوع استرومایسیس. : فقط یک یا دو گونه در این مطالعه استفاده شد. حلال استفاده شده در روش استخراج تنها زمانی ارجاع داده می‌شود که بر حساسیت و/یا مقاومت تأثیر بگذارد. بیش از یک باکتری یا قارچ در صورتی گزارش می شود که اختلافات جزئی در حساسیت وجود داشته باشد.

جدول 4. فعالیت ضد میکروبی نمونه های نان زنبور از کشورهای مختلف

r: سویه مقاوم به آنتی بیوتیک. با توجه به اینکه نمونه‌هایی از منشا گیاهی متنوع یا حتی با منشاء گیاهی یکسان اما استخراج شده با حلال‌های مختلف، فعالیت متفاوتی ازخود نشان می‌دهند، حداقل غلظت بازدارنده (MIC) گزارش‌شده پایین، حساس‌ترین سویه را تعریف می‌کند و MIC بالاتر، مقاوم‌ترین سویه را (در برخی موارد مشابه هستند). بیش از یک باکتری یا قارچ در صورتی گزارش می شود که اختلافات جزئی در حساسیت وجود داشته باشد.

117 نمونه BCP و 20 نمونه نان زنبور در مطالعات منتشر شده برای فعالیت ضد میکروبی آنها ارزیابی شدند. اکثر مطالعات روی BCP، 1 تا 5 نمونه را ارزیابی می کنند. بدیهی است که تعداد بیشتر نمونه‌های بررسی‌شده، تصویر دقیق‌تری از خواص ضد میکروبی که به‌شدت با ترکیب شیمیایی و در نتیجه با منشا گیاهی مرتبط هستند، ارائه می‌کند. علاوه بر این، تعداد بیشتر مطالعات انجام شده، مواد طبیعی جدیدی را که فعالیت ضد میکروبی هدفمند را علیه پاتوژن‌های خاص اعمال می‌کنند، شناسایی خواهد کرد.

با توجه به اینکه نمونه‌های با منشاء گیاهی متنوع یا حتی با منشاء گیاهی یکسان اما استخراج شده با حلال‌های مختلف، فعالیت متفاوتی ازخود نشان می‌دهند، کمترین حداقل غلظت بازدارنده (MIC) گزارش‌شده، حساس‌ترین سویه را تعریف می‌کند و بالاترین MIC، مقاوم‌ترین سویه‌ها را (در برخی موارد مشابه هستند) را تعریف می‌کند. این مقایسه ممکن است فعالیت ضد میکروبی بهینه را در برابر پاتوژن های خاص در بین نمونه‌های متنوع (اصل گیاهی/جغرافیایی) یا روش‌های استخراج مختلف تعریف کند. به نظر می رسد که باکتری های گرم مثبت به طور کلی بیشتر مستعد ابتلا به BCP هستند [46، 47، 50، 126، 154، 165، 172] با برخی استثناهای قابل توجه [156، 163، 166].

با این وجود، در برخی مطالعات، بسته به حلال مورد استفاده در حین استخراج، همان نمونه BCP ممکن است علیه باکتری‌های گرم مثبت یا گرم منفی مؤثرتر باشد، همانطور که قبلاً ذکر شد. محققین گزارش دادند که باکتری های گرم منفی (E. coli و C. jejuni) نسبت به باکتری های گرم مثبت (L. monocytogenes) در برابر عصاره های BCP اسلوونیایی حساس تر بودند (جدول 3) [166]. همچنین عصاره‌های BCP از شیلی فعالیت ضد باکتریایی علیه S. pyogenes I.S.P. 364-00 از خود نشان دادند، اما هیچ فعالیت ضد باکتریایی علیه E. coli ATCC-25922، S. aureus ATCC-25923 و P. aeruginosa ATCC-27853 نداشتند [126].

مطالعه ای روی BCP اسلواکی نشان داد که سویه‌های میکروبی بسته به حلال مورد استفاده برای استخراج نمونه BCP، حساسیت متفاوتی از خود نشان دادند. E. coli CCM 3988 در هنگام آزمایش در برابر عصاره‌های اتانول 70%، حساس‌ترین سویه باکتریایی بوده است. برعکس، دربرابر عصاره اتانول 96%، این سویه بسیار مقاوم‌تر بود. P. aeruginosa CCM 1960، مقاوم‌ترین سویه در برابر تمام عصاره‌های حلال آزمایش شده بود. این یافته‌ها نشان می دهد که ویژگی سویه بسته به حلال مورد استفاده (مانند متانول، اتانول) یا غلظت (مانند اتانول 96٪ یا 70٪) وجود دارد [157]. همین یافته در مورد A. fumigatus نیز مشاهده شد. این قارچ در هنگام آزمایش در برابر عصاره اتانول 70 درصد در میانگونه‌های Aspergillus حساس‌ترین بود اما در هنگام آزمایش در برابر عصاره متانول 70 درصد مقاوم‌ترین بود.

در مطالعه دیگری روی گرده Trifolium alexanderinum L. جمع آوری شده توسط زنبورعسل، از اتانول برای استخراج اولیه و در ادامه شکسته‌سازی با استفاده از حلال هایی با قطبیت فزاینده، مانند نفت اتر، دی کلرومتان و اتیل استات استفاده شد. این روش بر محتوای فنولیک، و همچنین فعالیت آنتی اکسیدانی و ضد میکروبی عصاره تأثیر گذاشت. عصاره اولیه اتانول، بخش نفت اتر و دی کلرومتان بالاترین فعالیت ضد میکروبی را دربرابر میکروارگانیسم های آزمایش شده نشان دادند، درحالی که اتیل استات کمترین فعالیت ضد میکروبی را نشان داد. بااین وجود، بخش اتیل استات، در کنار عصاره اتانول، بالاترین محتوای فنولیک و فلاونوئیدی و همچنین بالاترین فعالیت آنتی اکسیدانی را نشان داد [163]. این یافته‌ها نشان می‌دهد که نه محتوای کل فنولیک/فلاونوئیدی و نه فعالیت آنتی اکسیدانی با فعالیت ضد میکروبی نسبت مستقیم ندارند.

در همان مطالعه، AbdElsalam و همکاران نشان دادند که عصاره اولیه اتانول 70 درصد بالاترین فعالیت ضد باکتریایی را در برابر S. aureus (ناحیه مهار 38 میلی متر)، و پس از آن P. aeruginosa (ناحیه مهار 33 میلی متر) از خود نشان داده است. در مقابل، بخش نفت اتر بیشترین فعالیت را در برابر P. aeruginosa (ناحیه مهار 41 میلی متر) و پس از آن S. aureus (ناحیه مهار 33 میلی متر) نشان داد. نکته قابل توجه این است که بخش نفت اتر برخلاف سایر قسمت‌های حلال، هیچ فعالیتی در برابر A. niger نداشت.

اگرچه مطالعات بسیار کمی در رابطه با فعالیت ضد میکروبی نان زنبور انجام شده است (جدول 4)، به نظر می رسد یافته‌های اصلی مشابه با فعالیت ضد میکروبی BCP است. برای مثال باکتری های گرم مثبت حساسیت بیشتری به نان زنبور دارند تا گرم منفی [35، 172] اگرچه همیشه هم اینطور نیست [50، 168].

بدیهی است که تفاوت قابل توجهی در رابطه با فعالیت ضد میکروبی BCP و نان زنبور بسته به منشا گیاهی، روش استخراج و میکروارگانیسم مورد آزمایش وجود دارد. لازم به ذکر است که مطالعاتی وجود دارد (جدول 3) که در آن فعالیت ضد میکروبی اصلاً تشخیص داده نشد [161]، یا به طور متوسط شناسایی شد [126، 165]. بنابراین، یک سنجش غربالگری جهانی باید به منظور بهینه‌سازی فعالیت علیه یک پاتوژن خاص، به روشی مشابه آنتی‌بیوگرام توسعه یابد.

گزارش شده است که عصاره‌های BCP یونانی حاوی فلاونوئیدهای زیر هستند: کامفرول 3-O-رامنوزید، کوئرستین 3-O-گلوکوزید، کوئرستین 3-O-گالاکتوزید، کوئرستین 3-O-رامنوزید، ایزورامنتین 3-O-xylosyl (1-6)، گلوکوزید O-methylherbacetin 3-O-sophoroside، و 7-O-methylherbacetin 3-O-glucosyl-8-O-galactoside. این مولکول‌ها به صورت خالص علیه باکتری‌های گرم مثبت و گرم منفی استفاده شدند و هر دو را مهار کردند. با این حال، مقادیر کمتری برای حداقل غلظت بازدارنده (MIC) علیه باکتری های گرم مثبت محاسبه شد [46].

تاثیر عصاره‌های BCP و نان زنبور بر میکروبیوم میزبان باید درآینده بررسی شود. آنتی‌بیوتیک‌ها به طور انتخابی پاتوژن ها و پروبیوتیک‌ها را می‌کشند. جالب اینجاست که گزارش شده است که BCP فعالیت ضد باکتریایی دربرابر باکتری‌های بیماری زا نشان می‌دهد اما نه برعلیه کشت‌های شروع‌کننده اسید لاکتیک [155]. علاوه بر این، کوئرستین اگلیکون، یک ترکیب BCP، هیچ فعالیتی دربرابر L. casei var shirota اعمال نکرد [175]. کوئرستین به طور قابل توجهی پتانسیل پروبیوتیک میکروبیوم نابینایان روده را بهبود بخشید. کاهش در تعداد واحد‌های تشکیل کلنی (CFUs) P. aeruginosa، S. typhimurium، S. aureus و E. coli مشاهده شد اما تعداد CFU های Lactobacillus spp.، Bifidobacterium spp. و کل باکتری ها به طور چشمگیری افزایش یافت [176]. محتمل است که ترکیبات BCP و نان زنبور فعالیت هدفمندی را علیه عوامل بیماری‌زا اعمال می‌کنند بدون اینکه میکروبیوم میزبان را مختل کنند، اما تحقیقات بیشتری باید انجام شود.

جدول 5 و جدول 6 فعالیت BCP و نان زنبور علیه دو عامل باکتریایی مهم و برخی قارچ‌ها را به صورت کمی نشان می‌دهند. مقادیر MIC از 1-3 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر تا 2 میکروگرم بر میلی‌لیتر متغیر است، که در برخی موارد مشابه یا برتر از آنتی بیوتیک ها در عمل بالینی است. به عنوان مثال، عصاره‌های نان زنبور مراکشی مقادیر MIC و حداقل غلظت باکتری‌کُش (MBC) برتری در مقایسه با آنتی‌بیوتیک‌ها علیه عوامل بیماری‌زای مورد آزمایش نشان دادند [35]. مقادیر MBC عصاره‌های نان زنبور مراکشی علیه S. typhimurium (ATCC 13311) و L. monocytogenes (NCTC 7973) برای هر دو باکتری 0.175 میلی‌گرم در میلی‌لیتر بود. مقادیر MBC آمپی‌سیلین در برابر S. typhimurium (ATCC 13311) و L. monocytogenes (NCTC 7973) به ترتیب 1.20 میلی‌گرم در میلی‌لیتر و 0.50 میلی‌گرم در میلی‌لیتر بود. در مقایسه مقادیر MBC استرپتومایسین علیه S. typhimurium (ATCC 13311) و L. monocytogenes (NCTC 7973) 0.30 میلی گرم در میلی‌لیتر بود. Khider و همکاران فعالیت ضد میکروبی عصاره های BCP ذرت (Zea mays)، شبدر (Trifolium alexandrinum) و نخل خرما (Phoenix dactylifera) را با یازده آنتی‌بیوتیک مقایسه کردند. عصاره خام متانولی BCP ذرت و شبدر فعالیت مهاری (مقادیر MIC به ترتیب از 320 تا 1280 میکروگرم بر میلی‌لیتر و 320 تا 640 میکروگرم بر میلی‌لیتر بود) دربرابر باکتری‌های بیماری‌زا را نشان داد. این فعالیت ضد باکتریایی مشابه آنتی‌بیوتیک‌ها بود [155]. مقادیر MIC قابل مقایسه با آنتی بیوتیک‌ها نیز برای عصاره‌های BCP مشتق‌شده از گیاه بومی یونانی Cistus creticus L. (صمغ لادن) گزارش شده است [169].

جدول 5. مقادیر MIC (میلی‌گرم بر میلی‌لیتر) BCP و نان زنبور علیه سویه‌های مختلف S. aureus و P. aeruginosa

جدول 6. مقادیر MIC (میلی‌گرم بر میلی‌لیتر) نمونه‌های BCP و نان زنبور علیه سویه‌های قارچ‌ها و مخمرها

به طورکلی P. aeruginosa یکی از مقاوم‌ترین باکتری‌ها در برابر BCP و نان زنبور است. در همه موارد مقادیر MIC علیه P. aeruginosa بالاتر از مقادیر علیه S. aureus بود. مقاومت اعمال‌شده توسط باکتری های گرم منفی ممکن است به ساختار دیواره سلولی نسبت داده شود که پیچیده‌تر از باکتری‌های گرم مثبت است [47، 50، 154، 155]. علاوه براین، حساسیت بیشتر باکتری های گرم مثبت هنگام آزمایش نمونه‌های نان زنبور از Apis mellifera و سایر گونه‌های زنبورعسل مانند زنبورعسل بدون نیش Heterotrigona itama نیز مشاهده شده است [174].

در برخی مطالعات، فعالیت ضد میکروبی با محتوای کل فنولیک مرتبط است [177]. سایر محققین پیشنهاد می‌کنند که این محتوای کل فنولیک به خودی خود نیست، بلکه ترکیب آن است که با فعالیت ضد میکروبی مرتبط است. این موضوع با این واقعیت تایید می شود که عصاره‌های BCP با کمترین غلظت کل فنولیک موثرترین در برابر میکروارگانیسم‌ها بودند [47، 73، 99].

گزارش شده است که اسیدهای چرب مانند لینولئیک، لینولنیک، میریستیک و لوریک نیز خواص باکتری‌کُش و ضد قارچی دارند [99]. اسیدهای چرب آزاد (FFAs) را می توان از اسیدهای چرب یا لیپیدها عمدتاً از طریق فعالیت آنزیمی آزاد کرد. خواص ضدباکتریایی FFA ها عمدتاً به دلیل تخریب زنجیره انتقال الکترون و فسفوریلاسیون اکسیداتیو غشای سلولی است. علاوه براین، FFA ها همچنین ممکن است جذب مواد مغذی را مختل کنند، پراکسیداسیون سمی ایجاد کرده و باعث لیز مستقیم سلول های باکتریایی شوند [67]. پتانسیل FFA ها به عنوان عوامل ضد باکتری به طور گسترده ای به رسمیت شناخته شده است [68].

ترکیبات پلی فنولی که اغلب در BCP شناسایی می‌شوند و نحوه عملکرد ضد میکروبی آنها در جدول 7 ارائه شده است. نحوه عملکرد با استفاده از این ترکیبات به‌دست‌آمده از گیاهان یا اشکال مصنوعی آنها، نه عصاره‌های خام BCB یا نان زنبور، توضیح داده شد.

جدول 7. ترکیبات ضد میکروبی موجود در BCP و مکانیسم اثر آنها

کوئرستین و کامفرول (سنتتیک) که علیه C. parapsilosis آزمایش شدند، هم تشکیل بیوفیلم و هم رشد سلول‌های پلانکتونیک را مهار می‌کنند [178].

به طور مشابه، لوتئولین فعالیت ضد باکتریایی در برابر سلول‌های پلانکتونیک و تشکیل بیوفیلم سه سویه S. aureus و سه سویه L. monocytogenes از خود نشان می‌دهد [179].

آپیژنین (سنتتیک) آنزیم d-alanine:d-alanine ligase [180] را مهار می‌کند، که تولید پیش‌ساز پپتیدوگلیکان، d-ala-d-ala را کاتالیز می‌کند، بنابراین دیواره سلولی باکتریایی را بی‌ثبات می‌کند. آپیژنین که به‌صورت هم‌افزایی با سایر فلاون‌ها آزمایش شد، تولید عواملبیماری P. aeruginosa ازجمله سیتوتوکسین و پیوسیانین را کاهش داد. برعکس، اثر ضعیفی بر رشد دو ایزوله بالینی کوآگولاز منفی استافیلوکوک (CNS) و دو استافیلوکوک اورئوس مقاوم به متی‌سیلین (MRSA) مشاهده شد. این داده‌ها نشان می‌دهد که فلاون‌ها ممکن است پتانسیل ضد گرم منفی داشته باشند [181].

گالانژین یک جزء فعال است که در محصولات زنبورعسل مانند BCP و پروپولیس و همچنین در گیاهانی مانند Helichrysum aureonitens که به‌طور سنتی برای درمان عفونت‌ها از آن استفاده می‌شود، یافت می‌شود. گالانژین (سنتتیک) منجر به اتلاف قابل توجه پتاسیم در سلول‌های S. aureus می‌شود که ممکن است به دلیل اختلال در غشای سیتوپلاسمی باشد [182]. گالانژین به گونه‌ای توصیف شده است که بیان ایزوآنزیم‌های سیتوکروم P450 را در رت‌ها در تجویز طولانی مدت تغییر می‌دهد. این نشان می‌دهد که گالانژین می تواند برای افزایش زیست‌فراهمی داروی خوراکی و معکوس کردن مقاومت چنددارویی اجرا شود [183]. مطالعات بیشتری باید درآینده برای روشن شدن تأثیر گالانژین یا سایر فلاونوئیدها بر زیست‌فراهمی آنتی‌بیوتیک انجام شود.

اسید گالیک و اسید فرولیک با تغییر آبگریزی یکپارچگی غشایی را از بین می‌برند و باعث پارگی موضعی غشا یا تشکیل منفذ می‌شوند. جالب اینکه باکتری‌های گرم منفی حساس‌تر از باکتری های گرم مثبت بودند. P. aeruginosa حساس‌ترین باکتری به اسید گالیک بود که MIC آن 500 میکروگرم بر میلی‌لیتر بود. همراه با E. coli، آن‌ها حساس‌ترین به اسید فرولیک با MIC در 100 میکروگرم بر میلی‌لیتر بودند. باکتری‌های گرم مثبت حساسیت کمتری به هر دو اسیدفنولیک داشتند؛ MIC برابر با 1750 میکروگرم بر میلی‌لیتر برای اسید گالیک و 1100 میکروگرم در میلی‌لیتر برای اسیدفرولیک درمورد S. aureus. برای L. monocytogenes مقادیر MIC به ترتیب 2000 میکروگرم بر میلی‌لیتر و 1250 میکروگرم بر میلی‌لیتر بود [184].

استرهای اسید کافئیک رشد باکتریایی عامل بیماری‌زا P. larvae را از طریق مکانیسم استرس اکسیداتیو مهار کردند [185].

اسید p-کوماریک دارای مکانیسم دوگانه فعالیت باکتری‌کُش است که غشای سلول‌های باکتریایی را مختل می‌کند و به DNA ژنومی باکتری می‌چسبد، بنابراین منجر به مرگ سلولی می‌شود. اسید p-کوماریک به طور قابل توجهی نفوذپذیری غشا را افزایش می دهد و منجر به از دست دادن عملکرد سد غشایی می‌شود. همچنین نشان داده شد که اسید p-کوماریک می‌تواند به آنیون فسفات در مارپیچ دوگانه DNA بچسبد و در DNA نفوذ کند [186].

زیست‌فراهمی ترکیبات فنولیک یک عامل مهم برای روشن کردن عملکرد ضد میکروبی آنها است. با توجه به فلاونوئیدها، جذب در روده کوچک اتفاق می‌افتد و به چندین عامل بستگی دارد. بالاترین زیست‌فراهمی برای ایزوفلاون‌ها و پس از آن فلاوانول‌ها، فلاوانون‌ها و فلاونول گلیکوزیدها تعیین شده است.

فلاونوئید گلیکوزیدها پیش ازجذب روده‌ای دگلیکوزیله می‌شوند، درحالیکه اگلیکون ها می‌توانند آزادانه در غشای سلولی نفوذ کنند. پس از آن، فلاونوئیدهای جذب‌شده به کبد منتقل می‌شوند و در آنجا متابولیسم گسترده‌ای را از سر می‌گذرانند، بنابراین فرم‌های مختلف مزدوج مانند گلوکورونیدها، سولفات‌ها و مشتقات متیله‌شده تولید می‌شوند. این مزدوج‌ها مسئول اثرات ارتقاء دهنده سلامت فلاونوئیدها هستند [187]. مقادیر کمی از فلاونوئید گلیکوزیدها مانند کوئرستین-3-O-گلوکوزید، روتین و سایر کوئرستین گلیکوزیدها در جریان خون شناسایی می‌شوند که نشان‌دهنده مکانیسم جذب مستقیم است [188،189]. منطقی است که فرض کنیم فرآیند دگلیکوزیلاسیون فلاونوئیدها، صرف‌نظر از منشا آنها (BCP یا سایر قسمت های گیاهی)، منجر به محصولات اگلیکونی می‌شود. در دستگاه گوارش ممکن است یک عملکرد مستقیم هم از فرم‌های گلیکوزیله‌شده و هم اگلیکونی صورت گیرد. این عملکرد می‌تواند به کنترل عفونت‌های روده‌ای ناشی از H. pylori و پاتوژن‌های منتقله از غذا کمک کند [180، 190، 191].

سایر ترکیبات فنولیک، مانند اسیدهای فنولیک، پس از جذب در دستگاه گوارش به طور گسترده متابولیزه می شوند. این شامل متیلاسیون، گلوکورونیداسیون و سولفاتاسیون است. سولفاتاسیون و گلوکورونیداسیون بر فعالیت آنتی اکسیدانی آنها تأثیر منفی می‌گذارد. داده‌های محدودی در مورد فعالیت بیولوژیکی متابولیت‌های اسید فنولیک وجود دارد. اسیدهای فنولیک فعالیت ضد میکروبی از خود نشان میدهند و همچنین به عنوان نگهدارنده مواد غذایی عمل می‌کنند. پتانسیل ضد میکروبی اسیدهای فنولیک به ساختار شیمیایی آنها به ویژه به طول زنجیره اشباع‌شده، موقعیت و تعداد جایگزینی ها در حلقه های بنزنی هسته بستگی دارد [192].

اخیراً، وزیکول‌های شبیه اگزوزوم (EXLVs) در ترشحات غدد هیپوفارنکس Apis mellifera و در محصولات زنبورعسل (عسل، ژل رویال و گرده زنبورعسل) شناسایی شدند. EXLV ها اثرات باکتریواستاتیک، باکتری‌کُش و مهار کننده بیوفیلم را بر S. aureus اعمال کردند [60].

و نکته‌ی آخر اینکه نشانه‌هایی وجود دارد که متابولیت‌های تولید شده توسط میکروبیوم BCP و نان زنبور به فعالیت ضد میکروبی آنها کمک می‌کند. فعالیت ضد میکروبی در BCP تلقیح‌شده با سویه‌های منتخب اسید لاکتیک و مخمر در یک فرآیند تخمیر شبیه‌سازی تبدیل BCP به نان زنبور مشخص شده است. ممانعت علیه میکروارگانیسم‌های آزمایش‌شده پس از تخمیر با برخی از سویه‌های L. kunkeei اعمال شد درحالی که عصاره گرده تخمیر نشده هیچ فعالیت ضد میکروبی نشان نداد. این یافته نشان می‌دهد که فعالیت ضد میکروبی را می‌توان به متابولیت‌های خاصی نسبت داد که عمدتاً توسط سویه‌های L. kunkeei تولید می‌شوند [152]. در یک مطالعه بسیار اخیر پس از تخمیر خودبه‌خودی BCP و تخمیر با L. lactis و L. rhamnosus افزوده شده، محتوا کل فنولیک و فلاونوئیدی و همچنین فعالیت پاکسازی رادیکال آزاد از 1.27 تا 2.40 برابر، فعالیت ضد باکتریایی علیه M. luteus، S. aureus و E. coli 1.08-16.9 برابر افزایش یافت و فعالیت ضد قارچی علیه P. roqueforti 1.96 تا 5.52 برابر پس از تخمیر گرده زنبورعسل افزایش یافت [48]. این مطالعات به وضوح نشان می‌دهند که فعالیت ضد میکروبی اعمال‌شده توسط نان زنبور، نه تنها به فیتوکمیکال‌های گرده، بلکه به متابولیت‌های تولیدشده توسط میکروبیوم BCP و نان زنبور نیز می‌تواند نسبت داده شود. با این وجود، این باید در مطالعات آتی تأیید شود.

BCP و گرده گل به طور بالقوه فعالیت ضد ویروسی از خود نشان می‌دهند. با این‌حال، مطالعات فعلی بر روی فعالیت ضد ویروسی ترکیبات BCP متمرکز شده‌اند و نه عصاره‌های BCP یا نان زنبور. فلاونوئیدها و یک آلکالوئید موجود درBCP کره ای Papaver rhoeas فعالیت مهاری نورامینیداز در برابر سویه‌های آنفلوانزای H1N1، H3N2 و H5N1 از خود نشان می‌دهند. فلاونوئیدهای آزمایش‌شده عبارت بودند از کامفرول-3-سوفوروزید، کامفرول-3-نئوهسپریدوزید، کامفرول-3-سامبیوبیوزید، کامفرول-3-گلوکوزید، کوئرستین-3-سوفوروزید، لوتئولین و چلیانتفولین. همه ترکیبات فعالیت‌های مهاری نورامینیداز با مقادیر IC50 از 10.7 تا 151.1 میکرومولار نشان داده‌اند. لوتئولین، که فلاونوئید غالب در بخش استات اتیل بود، قوی‌ترین مهارکننده نورامینیداز بود [69]. عصاره‌های به‌دست‌آمده از گرده خرما، فعالیت ضد ویروسی علیه ویروس استوماتیت وزیکولار نشان دادند که پس از تخمیر با استفاده از Trichoderma koningii بیشتر افزایش یافت. تخمیر گرده تولید استر اسید چرب غیراشباع و فلاونوئیدها را بهبود بخشید [193]. فلاونوئیدها فعالیت علیه ویروس هرپس سیمپلکس-1 (HSV-1) و ویروس هرپس سیمپلکس-2 (HSV-2) نشان داده‌اند. در میان فلاونول‌ها، گالانژین و کامفرول، قوی‌ترین فعالیت ضد ویروسی را از خود نشان دادند [194]. گالانژین جدا شده از شاخه های Helichrysum aureonitens فعالیت ضد ویروسی قابل توجهی علیه HSV-1 و کوکساکی B1 نشان داد [195]. علاوه براین، کوئرستین میل ترکیبی به پروتئین HA آنفلوانزا نشان داد و ورود ویروس H5N1 را به سلول‌های میزبان مهار کرد [196].

علاقه تحقیقاتی در مورد تعامل فلاونوئیدها با پروتئازهای ویروسی SARS-CoV و MERS-CoV وجود دارد [197، 198]. جالب توجه است که کوئرستین، کامفرول و مشتقات گلیکوزید آنها که با غلظت بالا در BCP وجود دارند، ممکن است فعالیت ضد ویروسی علیه SARS-CoV-2 و MERS از خود نشان دهند [199]. کوئرستین و مشتقات آن فعالیت ضد ویروسی این‌ویترو در برابر چندین ویروس نشان می‌دهند که DNA و RNA پلی‌مرازهای ویروسی را مهار می‌کنند یا به پروتئین‌های ضروری ویروسی متصل می‌شوند [200]. کوئرستین-3β-گالاکتوزید، به پروتئاز شبه کیموتریپسین (3CLpro) SARS-CoV، در باقی‌مانده Gln189 متصل می‌شود و فعالیت پروتئولیتیک آن را مسدود می‌کند [201]. SARS-CoV-2 3CLpro بسیار شبیه به پروتئازِ SARS-CoV است و همان باقی‌مانده را در محل فعال خود حفظ می‌کند [202]، بنابراین ممکن است نسبت به اثر مهاری کوئرستین و مشتقات آن نیز حساس باشد. جالب توجه است که ما توالی پروتئین‌های 3CLpro را از ژنوم‌های بتا کروناویروس موجود در دسترس عموم و از هر 5 زیرجنس تراز کردیم و مشاهده کردیم که این باقی‌مانده (Gln 189) 100٪ در همه آنها حفظ شده است [داده‌های منتشر نشده از Amoutzias]. پروتئین 3a یکی از سه کانال یونی فرضی SARS-CoV-2 را تشکیل می‌دهد که در سلول آلوده بیان می‌شود و در ترشح ویروس نقش دارد[203]. کامفرول و آنالوگ‌های گلیکوزید آن پروتئین کانال 3a کروناویروس را مهار می‌کنند [204].

با در نظر گرفتن تمام داده های موجود، ‌محتوا کل فنولیک و ترکیب فنول دو عامل اصلی هستند که مستقیماً با فعالیت ضد میکروبی عصاره های BCP ارتباط دارند. عوامل ضد میکروبی دیگری مانند اسیدهای چرب، EXLV ها و احتمالاً متابولیت های میکروبی نیز وجود دارد. فیتواسترول‌ها می‌توانند به‌صورت هم‌افزایی عمل کرده و خواص ضد میکروبی عوامل ذکر شده در بالا را افزایش دهند [205]. اگرچه مطالعات بسیار کمی غلظت این مواد فعال را در BCP یا نان زنبور اندازه‌گیری می‌کنند، ولی ممکن است ترکیبات موجود در گرده در گرده جمع‌آوری شده توسط زنبورعسل و همچنین در نان زنبور نیز وجود داشته باشد، اما غلظت آنها هنوز نیاز به مطالعه بیشتر دارد.

چندین مطالعه نشان داده‌اند که ترکیبات BCP می‌توانند به صورت هم‌افزایی علیه عوامل بیماری‌زا عمل کنند [46، 155، 209]. علاوه براین، پیشنهاد شده است که عصاره‌های BCP یا ترکیبات خاص BCP می‌توانند فعالیت ضد میکروبی را به‌صورت هم‌افزایی با آنتی‌بیوتیک‌ها اعمال کنند [154]. این مورد برای کامفرول گلیکوزیدهای منشا گیاهی به‌صورت هم‌افزایی با فلوئوروکینولون‌های هیدروفیل در برابر استافیلوکوک اورئوس مقاوم به متی‌سیلین (MRSA) آزمایش شده است. کامفرول MIC آنتی بیوتیک مورد استفاده را به شدت کاهش می دهد [206]. از سوی‌دیگر، آپیژنین مورد استفاده در ترکیب با سایر فلاون‌ها، فعالیت ضد میکروبی یک ترکیب پنی سیلین/استرپتومایسین را در برابر استافیلوکوک کواگولاز منفی (CNS) و دو سویه MRSA افزایش نمی‌دهد. در همان مطالعه، هم‌افزایی در برابر P. aeruginosa در حضور آنتی‌بیوتیک‌ها یا لیزوزیم انسانی نوترکیب مشاهده شد [181]. برای انتخاب مناسب عصاره های BCP یا نان زنبور یا ترکیبات آنها که می‌توانند در ترکیب با آنتی‌بیوتیک‌های خاصی استفاده شوند، باید یک پروتکل استاندارد ایجاد شود. هم‌افزایی BCP و نان زنبور با آنتی‌بیوتیک‌ها می تواند از مقاومت ضد میکروبی جلوگیری کرده یا به تعویق بیاندازد [206]. تاکنون گزارشی مبنی بر ایجاد مقاومت میکروارگانیسم ها علیه ترکیبی از ترکیبات موجود در BCP یا نان زنبور وجود ندارد، اما این باید در مطالعات آینده تأیید شود. نیاز مبرمی به عوامل ضد قارچی جدید غیر سمی و کارآمد وجود دارد. از این نظر، محصولات زنبورعسل و به ویژه پروپولیس و گرده، می توانند به کنترل سویه های قارچی مقاوم به فلوکونازول کمک کنند [170].

6. نتیجه‌گیری و چشم‌اندازهای آینده

بدیهی است که BCP و نان زنبور عوامل ضد میکروبی امیدوارکننده‌ای برای کنترل باکتری‌های مقاوم به چند دارو و سایر عوامل بیماری‌زا از جمله ویروس ها هستند.

بااین‌حال، خواص ضد میکروبی اعمال‌شده توسط BCP و نان زنبور بسیار متغیر است. این تنوع می‌تواند به تفاوت در ترکیب شیمیایی نسبت داده شود که مستقیماً با منشا گیاهی گرده مرتبط است. غلظت مواد شیمیایی گیاهی، از جمله فلاونوئیدها، اسیدهای فنولیک، اسیدهای چرب و فیتواسترول ها در میان گونه‌های مختلف گیاهی به طور قابل‌توجهی متفاوت است.

با توجه به تنوع عظیم گیاهی در طیف وسیعی از زیستگاه‌هایی که زنبورهای عسل گرده را جمع‌آوری می‌کنند، بدیهی است که تاکنون بخش کوچکی از این تنوع زیستی مورد آزمایش قرار گرفته است. مطالعات بیشتری باید در سراسر جهان انجام شود تا ترکیبات ضد میکروبی جدید موجود در BCP و نان زنبور مشتق شده از گونه‌های گیاهی دارویی و بومی شناسایی شوند.

مقایسه داده‌ها و تفسیر نتایج بین مطالعات مختلف که بر روی فعالیت ضد میکروبی BCP و نان زنبور متمرکز هستند، گاهی اوقات به دلیل روش‌شناسی‌های متفاوت آسان نیست. نمونه‌برداری مهم است، به خصوص زمانی که نمونه‌ها مستقیماً از کندو تهیه نشده و از محصولات موجود در بازار تهیه می‌شوند. شرایط نگهداری ممکن است کیفیت نمونه را کاهش دهد. علاوه بر این، روش‌های استخراج با استفاده از حلال‌ها و پروتکل‌های مختلف ممکن است منجر به داده‌هایی شود که مقایسه آن‌ها سخت است، حتی اگر آنها از گیاهان یکسانی گرفته شده باشند. بنابراین، روش‌های عملیاتی استاندارد باید که شامل دستورالعمل‌های استخراج و همچنین سنجش‌های بیولوژیکی است توسط محققان حاضر در این حوضه تعیین و به یکدیگر اطلاع داده شود..

به عنوان مثال به رسمیت شناخته شده است که سنجش رقت مایع در مقایسه با سنجش انتشار آگار حساسیت بیشتری دارد. بنابراین، ممکن است اجرای این روش برای دریافت داده‌های قابل مقایسه مناسب‌تر باشد.

اگرچه تنوع بالایی درفعالیت ضد میکروبی BCP و نان زنبور وجود دارد، نتیجه گیری کلی زیر را می‌توان گرفت: BCP یا نان زنبور فعالیت ضد میکروبی انتخابی را نشان می‌دهند که معمولاً در برابر باکتری‌های گرم مثبت در مقایسه با باکتری‌های گرم منفی بالاتر است. برای شناسایی ترکیبات BCP/نان زنبور مسئول این عملکرد، باید ویژگی سویه‌های هدف بیشتر مورد بررسی قرار گیرد. از این نظر، مطالعات بیشتری باید در جهت بررسی هم‌افزایی عصاره‌های BCP و نان زنبور (یا ترکیبات شناسایی‌شده در آنها) و آنتی‌بیوتیک‌ها انجام شود. این هم‌افزایی می‌تواند از مقاومت میکروبی که یک معضل عمده بهداشت عمومی است جلوگیری کند یا آن را به تاخیر بی‌اندازد.

در مورد مکانیسم عمل، شواهد متقنی بر اساس ترکیباتی وجود دارد که عمدتاً از گیاهان گرفته شده اند. مشخص است که تحقیقات فشرده‌تری برای روشن کردن مکانیسم‌های مولکولی ضد میکروبی مورد نیاز است. فن‌آوری‌های پیشرفته OMICS مانند توالی‌یابی RNA باید برای شناسایی اهداف مولکولی عصاره‌های خام BCP/BB (یا ترکیبات خاص شناسایی شده در آنها) در پاتوژن‌های مختلف در سطح رونوشت‌برداری کامل اجرا شود.

یکی دیگر از فناوری های OMICS، توالی‌یابی نسل بعدی (NGS) قبلاً برای مطالعه میکروبیوم BCP و نان زنبور اجرا شده است. جوامع میکروبی به طور قابل‌توجهی در میان BCP و نان زنبور متفاوت است. LABها نقش محوری در تخمیر BCP به نان زنبور دارند، اگرچه مخمرها نیز ظاهراً نقش مهمی ایفا می‌کنند. اینکه آیا هضم اولیه دانه‌های گرده توسط میکروبیوتای نان زنبور اتفاق می‌افتد یا نه، هنوز بحث‌برانگیز است. محتمل است که میکروبیوم BCP و نان زنبور ترکیباتی (به عنوان مثال باکتریوسین‌ها) تولید می‌کند که فعالیت ضد میکروبی دارند. باز هم شواهد مستقیم هنوز وجود ندارد. تحقیقات آتی باید بیشتر میکروبیوم BCP/نان زنبور را نه تنها به عنوان منبعی از مواد ضد میکروبی، بلکه به عنوان یک نشانگر زیستی اصالت و کیفیت بررسی کند (برای مثال فراوانی نسبی بالای LABs می‌تواند پتانسیل پروبیوتیک را ایجاد کند). فناوری‌های NGS هزینه توالی‌یابی را به شدت کاهش داده و هم‌زمان ظرفیت فنی ما را برای به‌دست‌آوردن مجموعه‌های داده‌های ژنومی به‌صورت تصاعدی افزایش داده است. بنابراین، پیاده‌سازی گسترده NGS بر روی نمونه‌های BCP و نان زنبور از منشاء جغرافیایی و گیاهی متنوع می‌تواند منجر به اثرانگشت میکروبی منحصر به فردی شود که به عنوان نشانگرهای زیستی اصالت مفید است.

یکی دیگر از شاخه‌های مهم تحقیقاتی باید بر روی تأثیرات BCP و نان زنبور بر میکروبیوم روده انسان و پتانسیل پروبیوتیک آنها متمرکز شود. مطالعات دقیقی در مورد جذب مواد تشکیل‌دهنده و زیست‌فراهمی باید انجام شود تا اثرات BCP و نان زنبور بیشتر ارزیابی شود.

امروزه، مصرف‌کنندگان به دلیل ارزش غذایی بالا، و همچنین ترویج سلامتی و رفاه انسان، به شدت مشتاق سوپرغذاها و غذاهای عملکردی هستند. شکی نیست که BCP و نان زنبور را می توان به عنوان سوپرغذا در نظر گرفت. با این وجود، تحقیقات فشرده هنوز ضروری است تا شواهد قوی از ادعاهای سلامت و کاربردهای BCP و نان زنبور در عمل بالینی به‌عنوان منبع ضد میکروبی پشتیبانی کند.